融合劑
細胞融合的方法有物理法,如電融合、激光融合,化學(xué)融合法和生物融合法,如滅活的仙臺病毒,此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量為200~700時(shí),呈無(wú)色、無(wú)臭的粘稠狀液體,分子量大于1000時(shí),呈乳白色蠟狀固體,能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑,對熱穩定,與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者,常用濃度為50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3調整),分子量小的PEG,融合效應差,又有毒性,分子量過(guò)大,則粘性太大,不易操作。50%濃度,pH偏堿時(shí)融合效應最高。也有采用30%~50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。不同批號的PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時(shí)必須注意。每批都必須進(jìn)行細胞毒性試驗后方可應用。要買(mǎi)高純度的,一般選供氣相色譜用的PEG。
融合過(guò)程
融合的方法很多,常用的有轉動(dòng)法和離心法。融合時(shí)脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。
1.試劑與材料
(1)供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
(2)1640培養液100ml。
(3)完wan全1640液100ml。
(4)2.5%FCS-1640液50ml。
(5)HAT培養液100ml。
(6)50%PEG:取分子量4000,高純度的(日本進(jìn)口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調整。
(7)10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培養盤(pán)。
2.操作方法
⑴準備好脾細胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞,并加入50ml2.5%FCS-1640液。
⑶室溫400g離心3min,使細胞沉淀。
⑷移去上清液。
⑸輕敲管底部,使沉淀流動(dòng),把沉淀管放于40℃水浴中,使其達融合溫度。
⑹加預熱至40℃的50%PEG0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀(guān)察可見(jiàn)有顆粒出現,滴加過(guò)程要求持續2min。
⑺加1ml1640液,邊加邊搖動(dòng),持續1min。
⑻重復⑺一次。
⑼加1ml1640液,邊加邊搖動(dòng),持續0.5min。
⑽重復⑼一次。
⑾加1640液15ml。
⑿室溫,400g離心1min,使細胞沉淀。
⒀去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的wan全1640液。
⒁往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤(pán)中滴加融合的細胞液,每孔1滴(約0.05ml)。
⒂輕搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
⒃第3、6、9、10日換入含HAT的wan全1640培養液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細胞吸出,根據需要加入適量的飼養細胞。
⒄于第12、15日加入含有HAT的wan全1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀(guān)察,大約在10天左右就可觀(guān)察到雜交瘤細胞生長(cháng)出來(lái)。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現,但也有在1個(gè)月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后,吸取上清液,檢查抗體。
⒅對繼續生長(cháng)的雜交瘤細胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過(guò)程中,依情況取消HAT液和wan全1640液而代之以10%FCS-1640液。同時(shí)保存于液氮和進(jìn)行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產(chǎn)生抗體細胞的變異和丟失。
細胞融合關(guān)鍵
1.技術(shù)上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞沒(méi)有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2.融合試驗最大的失敗原因是污染,融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)無(wú)毒無(wú)菌的操作環(huán)境。