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【抗原檢測】雙抗體夾心法實(shí)驗操作步驟
點(diǎn)擊次數:38 更新時(shí)間:2024-07-11

  雙抗體夾心法是檢測抗原最chang用的方法,操作步驟如下:
  
  一、將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)。
  
  二、加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時(shí)間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。
  
  三、加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹di洗滌未結合的酶標抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
  
  四、加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據顏色反應的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
  
  根據同樣原理,將大分子抗體分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
  
  在臨床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步法檢測。
  
  在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物"。類(lèi)同于沉淀反應中抗原過(guò)剩的后帶現象,此時(shí)反應后顯色的吸光值(位于抗原過(guò)剩帶上)與標準曲線(xiàn)(位于抗體過(guò)剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結果將低于實(shí)際的含量,這種現象被稱(chēng)為鉤狀效應(hook effect),因為標準曲線(xiàn)到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時(shí),反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時(shí),應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類(lèi)試劑可削弱鉤狀效應。
  
  假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問(wèn)題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型,顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問(wèn)題。
  
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽(yáng)性反應。采用F(ab')或Fab片段作酶結合物的試劑,由于去除了Fc段,從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類(lèi)試劑的一項考核指標。
  
  雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
  
  反應模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y定,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法。

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